Технология пиросеквенирования

В нашей лаборатории для расшифровки олигонуклеотидной последовательности ДНК и РНК в качестве базового используется метод пиросеквенирования.

Пиросеквенирование («секвенирование путем синтеза») – определение первичной структуры ДНК, в основе которого лежит принцип комплементарности: для исследуемой одноцепочечной ДНК заново синтезируют комплементарную цепочку. В момент присоединения каждого нуклеотида регистрируется вспышка света. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются последовательно и элиминируются после реакции. Вспышка света детектируется в тот момент, когда раствор нуклеотида соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательное добавление растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.

Схема процесса пиросеквенирования

Шаг 1

Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.

Шаг 2

Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина.

Шаг 3

Добавление первого дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение dNTP сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов.

Шаг 4

АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’-фосфосульфата. АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.

Шаг 5

В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, невстроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.

Шаг 6

Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что дезоксиаденозин-альфа-тиофосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3-фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.

Принципиальная схема пиросеквенирования и пример пирограммы – двойные пики означают последовательное включение двух нуклеотидов.

По сравнению с методом пиросеквенирования другие методы имеют ряд существенных недостатков.

Так, метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) в силу технологических особенностей ограничен по списку генов и полиморфизмов и по этой же причине невысока достоверность результатов для многих полиморфизмов.

Гибридизационный метод, основанный на гибридизации различных олигонуклеотидных зондов с целью восстановления последовательности ДНК-мишени, также имеет ряд недостатков: довольно короткая длина прочтения (∼25bp), трудоемкая подготовка образцов, возможность кросс-гибридизации зондов из-за повторяющихся элементов или их случайного сходства. Последний фактор может явиться причиной значительной потери генетической информации.

Метод рестрикционного анализа основан на «разрезании» геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. К недостаткам этого метода можно отнести в первую очередь ограничение по списку генов и полиморфизмов (по причине конечного числа сайтов рестрикции для эндонуклеаз, крайне низкая достоверность результатов и значительное влияние человеческого фактора (высокая трудоемкость метода, большое количество ручного труда, отсутствие возможности автоматизации процесса).

Оборудование

Секвенатор PyroMark Q24 производства Qiagen предназначен для анализа генетических или эпигенетических модификаций ДНК и РНК, анализа экспрессии генов с использованием технологии пиросеквенирования. Заранее введенная для каждого генетического полиморфизма нуклеотидная последовательность обеспечивает встроенный контроль качества анализа.

Преимущества метода:

• быстрое и недвусмысленное определение результатов секвенирования;
• точность генотипирования определяется вероятностью ошибки при пиросеквенировании – менее 1 на 10 000 нуклеотидов
• благодаря заранее известным вариантам полиморфизмов реакция генотипирования может пройти либо по одному из известных протоколов, либо не пройти совсем – в данном методе нет так называемой «серой зоны».

Рассмотрим конкретный пример: