FISH на парафиновых срезах биопсии при немелкоклеточном раке легкого (определение перестройки ALK) - раздела Молекулярно-генетические исследования в области онкологии

В норме белок ALK активно экспрессируется (производится) в нервной ткани только на определенных этапах развития эмбриона.

Во взрослом возрасте экспрессия крайне низка и привязана к определенным типам тканей (головной мозг, кишечник, простата). В клетке может произойти транслокация (перестройка) гена ALK, в результате которой этот ген соединяется с другим геном, чаще всего EML4. Под действием регуляторных областей второго гена, они начинают экспрессироваться вместе, производя химерный (составной) белок.

В таком состоянии ALK приводит к нерегулируемой активации внутриклеточных белков-передатчиков пролиферативного сигнала (сигнала к делению), нарушая нормальную дифференцировку и апоптоз клетки, способствуя превращению нормальной клетки в опухолевую.

Подобная транслокация чаще всего обнаруживается методом FISH (флуоресцентная гибридизация in situ). Преимущество метода FISH заключается в возможности распознавать практически все виды перестроек гена ALK независимо от второго партнера транслокации, пригодности для исследования архивных блоков, цитологических препаратов, отпечатков и др.

ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase – киназа анапластической лимфомы) является рецептором с тирозинкиназной активностью и относится к суперсемейству рецепторов инсулиноподобных факторов роста. Рецептор ALK активирует внутриклеточные сигнальные пути RAS/MAPK, PI3K/AKT и JAK/STAT. В норме белок ALK активно экспрессируется (производится) в нервной ткани только на определенных этапах эмбриогенеза. Во взрослом возрасте экспрессия крайне низка и привязана к определенным типам тканей (головной мозг, кишечник, простата).

Транслокация гена ALK – это внутрихромосомная перестройка (парацентрическая инверсия) короткого плеча 2-й хромосомы, ведущая к образованию химерного онкогена EML4/ALK примерно в 95% случаев. Еще в 5% случаев транслокация возникает с участием других генов (KIF5B, TGF, KLC1 и др.). Известно как минимум 13 типов химерного транскрипта EML4/ALK. Во всех случаях в транслокации участвует тирозинкиназный домен ALK.

После транслокации ALK попадает под влияние регулирующих последовательностей EML4 или других партнеров и переходит в активное состояние, проявляя нерегулируемую киназную активность и приводя к активации внутриклеточных белков-передатчиков пролиферативного сигнала, нарушая нормальную дифференцировку и апоптоз клетки и способствуя злокачественному перерождению клетки.

Основным методом выявления перестроек гена ALK является метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Преимущество метода FISH заключается в возможности распознавать практически все виды перестроек гена ALK независимо от второго партнера транслокации, пригодности для исследования архивных блоков, цитологических препаратов, отпечатков и др.

При обнаружении перестройки ALK назначают препараты, блокирующие работу химерного онкогена (ингибиторы тирозинкиназ).

Последние рекомендации по молекулярно-генетическому тестированию немелкоклеточного рака легких, разработанные Колледжем американских патологов (CAP), Международной ассоциацией по изучению рака легких (IASCL) и Ассоциацией молекулярной патологии (AMP), предлагают обязательное определение перестроек гена ALK при аденокарциноме легкого с диким типом гена EGFR.

Для исследования ДНК используется предварительно подготовленный биологический материал (парафиновый блок с образцом ткани).

Непригодные для исследований образцы, приготовленные с использованием фиксаторов: Зенкера, Карнуа, Буэна, В-5, а также обработанные кислыми растворами, декальцифицирующими костную ткань.

По возможности образцы, предназначенные для выделения ДНК/РНК, не окрашивать (допустима окраска только крезилвиолетом).

Обращаем внимание, что на результаты исследования ДНК могут повлиять следующие факторы:

• в случае недостаточного объема пораженной ткани во взятом образце может быть получен ложноотрицательный результат;
• переливание крови или трансплантация костного мозга, стволовых клеток, органов и тканей, которые проводились в недавнем времени (в данном случае исследование ДНК не рекомендуется проводить в течение, как минимум, 1 месяца после трансплантации или переливания крови);
  
• контаминация образца чужим генетическим материалом (все манипуляции с образцами биологического материала рекомендуется проводить в стерильных перчатках)
  

Для выполнения данного исследования используются образцы ткани, зафиксированные в формалине и заключенные в парафиновый блок

Толщина образца

Оптимальная толщина образца ткани не должна превышать 5 мм

Заливка и фиксация биологического материала

Фиксацию препарата проводить при температуре +4...+10 °С, используя буферный раствор формалина. Процесс фиксации не должен превышать 24 часов (при фиксации ткани в течение 72 часов образуются необратимые сшивки в нуклеиновых кислотах, которые осложняют дальнейшие исследование ДНК/РНК). Соотношение количества формалина к ткани должно быть 10:1. Перед заливкой ткани в парафин нужно убедиться, что образец полностью обезвожен (остаточная вода может вызвать деградацию ДНК/РНК). Для заливки использовать парафин с низкой температурой плавления без примесей.

• По возможности образцы, предназначенные для выделения ДНК/РНК, не окрашивать (допустима окраска только крезилвиолетом).

• Непригодны для исследований образцы, приготовленные с использованием фиксаторов: Зенкера, Карнуа, Буэна, В-5, а также обработанные кислыми растворами, декальцифицирующими костную ткань.

Маркировка

На этикетке должна быть четко и разборчиво нанесена следующая информация, идентифицирующая образец биологического материала:

• фамилия, имя, отчество пациента;

• пол и возраст пациента;

• индивидуальный штрих-код пациента медицинского учреждения, если таковой имеется

Условия хранения

Парафинизированные образцы хранить в течение года при температуре от 0 до +10 °С (допустимо хранение при температуре +10 до +25°С) в специальном контейнере, предотвращающем попадание влаги и механические повреждения, при условии отсутствия попадания прямых солнечных лучей

Условия транспортировки

Транспортировку БМ следует осуществлять при температуре, соответствующей температуре хранения образца, в специальном контейнере, предотвращающем попадание влаги и механические повреждения, при условии отсутствия попадания прямых солнечных лучей

ВНИМАНИЕ!

Во избежание неопределенного результата генетические исследования не проводятся:

• после пересадки костного мозга, стволовых клеток, органов и тканей;
• после процедуры переливания крови в течение 3-х месяцев после проведения процедуры.